I. 概述

高爾基染色法是研究正常或異常狀態(tài)下神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的zui有效的技術(shù)^{2, 5}，利用高爾基染色技術(shù)可以檢測(cè)到藥物處理的動(dòng)物腦切片或神經(jīng)系統(tǒng)疾病死亡患者腦切片上神經(jīng)樹(shù)突/樹(shù)突棘的細(xì)微改變^{1, 3}。然而常規(guī)高爾基染色技術(shù)的可重復(fù)性及過(guò)程費(fèi)時(shí)極大的阻礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。根據(jù)Ramón-Moliner⁵， Glaser 與 Van der Loos⁴發(fā)表的研究方法及原理，本公司開(kāi)發(fā)出了FD快速高爾基染色試劑盒（FD Rapid GolgiStain? kit）。該試劑盒不僅極大的改進(jìn)和簡(jiǎn)化了常規(guī)高爾基染色法，而且在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)細(xì)節(jié)（特別是樹(shù)突棘）的檢測(cè)上更為可靠和靈敏。本試劑盒有效性已在多種動(dòng)物腦片及人類尸檢腦片上得到詳細(xì)驗(yàn)證。(部分圖片如下，登錄：www.fdneurotech。。ｃｏｍ 可查詢更多樣品圖片及應(yīng)用本試劑盒的參考文獻(xiàn))。

II. 試劑盒內(nèi)容物（室溫保存）

                          型號(hào)

PK401A      PK401

溶液A             125 ml        250 ml

溶液B             125 ml        250 ml

溶液C            125 ml x 2     250 ml x 2

溶液D             125 ml        250 ml

溶液E             125 ml        250 ml

玻璃取片器          2            2

毛刷                2            2

滴瓶                1            1

塑料夾              1            1

說(shuō)明書(shū)              1            1

III. 需自備材料及試劑

1. 雙蒸水或Milli-Q水

2. 塑料/玻璃瓶或管，

3. 病理染色設(shè)備，明膠包被的載玻璃片 (Cat. #PO101)，蓋玻片，染色缸，乙醇，二甲苯，封片劑，顯微鏡

IV. 操作注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒僅僅用于體外研究，不得用于藥物、診斷等其它用途。

2. 本試劑盒內(nèi)試劑皮膚接觸時(shí)為有毒有害，誤服有致命危險(xiǎn)，取用時(shí)用電動(dòng)移液器或洗耳球吸取（不得用嘴吸取），并避免吸入或接觸皮膚、眼睛。如有接觸需立即用大量水沖洗并及時(shí)就醫(yī)。加入誤服，應(yīng)吐出并用大量水漱口，并立即就醫(yī)。

3. 在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，穿戴防護(hù)服，手套，護(hù)眼眼睛。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后*清洗手部。

V. 組織準(zhǔn)備

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：（使用本試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀該部分）

所有容器（為塑料材質(zhì)）須洗凈并用雙蒸水沖洗。

在操作溶液A及溶液B是避免使用金屬容器。

使用過(guò)程中保持容器密閉。

使用溶液A與溶液B進(jìn)行處理（包括處理切片）時(shí)盡量保持避光。?

二、操作步驟：（以下步驟除明確要求外均在室溫下進(jìn)行）

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物須深度麻醉后處死，腦組織（或人尸體腦組織）應(yīng)盡快并小心取出，避免損傷或壓迫組織。

注意：除必要的情況下動(dòng)物無(wú)需灌注，如確實(shí)需要以4%多聚甲醛灌注動(dòng)物，應(yīng)少于5分鐘，并不用后固定。

大的腦組織（包括大鼠腦）應(yīng)以鋒利小刀切割成約10mm厚的小塊（重要）。

2. 雙蒸水或Milli-Q 水沖洗組織以除去表面血液。

3. 將組織浸入等體積的溶液A和溶液B混合而成的浸泡液中，室溫避光保存約2周，在浸入6小時(shí)或第二天更換浸泡溶液。通常2周的浸泡時(shí)間可以獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是不同大小及類型的組織需要的浸泡時(shí)間可能不同，因此，為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每種類型的組織在相同大小下仍需要預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定*浸泡時(shí)間，一般而言3周的浸泡時(shí)間對(duì)大多數(shù)組織均足夠。需要注意的是，浸泡時(shí)間越長(zhǎng)，背景染色越深。

注意事項(xiàng)：浸泡液需要在使用前24小時(shí)配置，并保持靜止，使用無(wú)沉淀的上清作為浸泡液。配置好的浸泡液可以在室溫下避光保存一個(gè)月。每一立方厘米至少使用5 ml浸泡液，浸泡液過(guò)少可減少染色敏感性及可靠性。同時(shí)，為獲得*染色效果，每周應(yīng)輕柔旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)浸有組織塊的容器兩次（切忌劇烈搖動(dòng)），每次幾秒即可。

i 警告:

溶液A及溶液B因含有有毒的氯化銀，重鉻酸鉀及鉻酸鉀，避免接觸皮膚，誤服可能致死。實(shí)驗(yàn)應(yīng)在化學(xué)通風(fēng)櫥或安全柜里進(jìn)行，并穿戴適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)服，手套及眼/臉保護(hù)設(shè)備。用完的溶液不得倒入下水道，應(yīng)裝入的容器內(nèi)，通知有害試劑回收部門進(jìn)行處理。

4. 將浸泡后的組織轉(zhuǎn)入溶液C，室溫避光保存72小時(shí)（zui多一周）。浸泡24小時(shí)后換液一次。

5. 在冰凍切片機(jī)上調(diào)整切片箱溫度（-20°C 到 -22°C）將組織片切成100到200 μm 切片（切片前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本條下的注意事項(xiàng)）。除冰凍切片機(jī)外，其它如滑動(dòng)式切片機(jī)或振動(dòng)切片機(jī)等也可以使用（細(xì)節(jié)請(qǐng)看本條下注意事項(xiàng)）。然后用本試劑盒提供玻璃取片器將切片轉(zhuǎn)移至滴有溶液C的明膠包被載波片上(Cat. #PO101) ，為便于在載波片上滴加溶液C，本試劑盒提供了一只滴瓶。載波片上多余的溶液應(yīng)以巴斯德管吸除，然后用吸水紙盡可能吸凈，或者可導(dǎo)致脫片。然后將切片自然風(fēng)干（切忌熱風(fēng)吹干或烤干）。為盡可能獲得好的染色結(jié)果，切片應(yīng)盡快進(jìn)行染色，如確需保存，可在室溫避光條件下保存zui多3天。

注意事項(xiàng)：

（1）、切片準(zhǔn)備：為避免組織冰凍是受到損壞，盡可能好的保持組織細(xì)胞形態(tài)，樣品應(yīng)在冰凍切片機(jī)上進(jìn)心速凍。例如：樣品可以如下方式進(jìn)行速凍：將樣品放在塑料勺中，緩慢浸入以干冰預(yù)冷的異戊烷（為獲得*結(jié)果，預(yù)冷的異戊烷應(yīng)低于零下70度，在1分鐘內(nèi)浸入，越慢越好），在組織*浸入異戊烷后，等待幾秒然后撈至干冰上放置一分鐘，以確保樣品達(dá)到*速凍狀態(tài)。在切片前切忌速凍好的樣品解凍。

（2）切片機(jī)選擇：能切出較厚切片的切片機(jī)均可選擇（如100um）。如冰凍切片機(jī)只有一個(gè)溫度控制，請(qǐng)?jiān)谇衅霸O(shè)置切片箱溫度至-22度至少4小時(shí)。如切片機(jī)有兩個(gè)溫度設(shè)置程序，請(qǐng)?jiān)O(shè)置切片箱溫度低于刀頭溫度1度。需要注意的是，-22度多數(shù)情況下可以獲得滿意的染色結(jié)果，然而不同的切片機(jī)與不同樣品可能需要高一些或低一些的切片溫度以保證切片的平滑與完整。

（3）以下內(nèi)容有助于冰凍切片機(jī)操作：1）使用雙蒸水將樣品裝到樣品盤上，并確保樣品未融化（可以在干冰上操作）。也可以用其它樣品凝固劑進(jìn)行安裝（如OCT）但是不要將樣品*包在凝固劑上，避免切片時(shí)刀片切到凝固劑。如果樣品必須包埋后才能切片，請(qǐng)使用TFM（TBS, Durham, NC, USA, Cat. #TFM-5）包埋。2）樣品裝上樣品盤后，干冰上放置10分鐘，然后立即將裝上樣品的樣品盤安裝到冰凍切片機(jī)上相應(yīng)位置，在切片前任其放置5分鐘。3）先試切幾片（勿使用防卷板），如樣品過(guò)冷（可能表現(xiàn)為與刀片平行的切片易碎），那么請(qǐng)等待幾分鐘再切，如切片符合要求，則可繼續(xù)切片。

? 灌注的腦組織也可以用瓊脂糖或白明膠包埋，然后用振動(dòng)切片機(jī)進(jìn)行切片，但是必須使用溶液C收集切片（切片機(jī)孵育槽里須注滿溶液C）。否則切片在干燥時(shí)可能碎裂。如用滑動(dòng)切片機(jī)切灌注的腦組織，刀臺(tái)和刀片均需要維持在低溫（低于零度），同樣，切片必須覆蓋在溶液C內(nèi)。

?

VI. 染色步驟：

1.雙蒸水或Milli-Q水清洗切片兩次，每次4分鐘。

2. 將切片放入混有1份溶液D，一份溶液E及兩份雙蒸水或Milli-Q水的混合液中處理 10分鐘。

如：溶液D10ml+溶液E10 ml+雙蒸水或Milli-Q水20 ml

注意事項(xiàng)：混合工作液須現(xiàn)用現(xiàn)配，100ml混合工作液zui多處理100張小鼠腦片（根據(jù)切片大小確定）。染缸必須加蓋以避免試劑蒸發(fā)，并不時(shí)旋轉(zhuǎn)攪動(dòng)孵育液。在整個(gè)染色過(guò)程中（封片前）均勿讓切片啊干燥。

3. 雙蒸水或Milli-Q水清洗切片兩次，每次4分鐘。(每次更換雙蒸水).

4. 甲酚紫或硫堇襯染（可選步驟），如要進(jìn)行襯染，步驟3中清洗時(shí)間和次數(shù)均要增加，如清洗4次，每次5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。

5. 50%、75%、95% 乙醇梯度脫水, 每個(gè)梯度4分鐘 (不可跳過(guò)某個(gè)濃度).

6. 無(wú)水乙醇脫水4次，每次4分鐘（不可增加時(shí)間）

7. 二甲苯透明3次，每次4分鐘，用Permount?封片。

注意事項(xiàng)：封片前切片可在二甲苯中存放幾小時(shí)，為獲得*染色效果，請(qǐng)使用純的未稀釋的Permount?封片。染色好的切片應(yīng)隨時(shí)避光。

VII. 已發(fā)表的使用本試劑盒的文章

1. Robinson TE, Kolb B (1997) Persistent structural modification in nucleus accum-bens and prefrontal cortex neurons produced by previous experience with ampheta-mine. J. Neurosci. 17:8491-8497.

2. Corsi P (1987) Camillo Golgi’s morphological approach to neuroanatomy. In Masland RL, Portera-Sanchez A and Toffano G (eds.), Neuroplasticity: a new therapeutic tool in the CNS pathology. pp 1-7. Berlin: Springer.

3. Graveland GA, Williams RS, DiFiglia M (1985) Evidence for degenerative and regenerative changes in neostriatal spiny neurons in Huntington’s disease. Science 227:770-773.

4. Glaser ME, Van der Loos H (1981) Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain. J. Neurosci. Methods 4:117-125.

5. Ramón-Moliner E (1970) The Golgi-Cox technique. In Nauta WJH

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