Sigma去糖基化試劑盒

Sigma-Aldrich 的天然蛋白去糖基化試劑盒（Native Protein Deglycosylation Kit，貨號(hào)NDEGLY）可在天然條件下去除糖蛋白上的N連接寡糖。糖基化蛋白修飾通常位于折疊蛋白中不容易接近的位置，因此在未變性的情況下，不大可 能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的肽N- 糖苷酶 F（PNGase F）處理來(lái)去除。如果您的下游分析需要折疊蛋白（如酶學(xué)分析或蛋白相互作用分析），那么這個(gè)試劑盒也許適合您。

此試劑盒包含了內(nèi)糖苷酶F1、F2和F3，以及相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液。與PNGase F相比，這些內(nèi)糖苷酶對(duì)蛋白構(gòu)象沒(méi)那么敏感，更適合在蛋白未變性的情況下去除各種N連接寡糖。這三種內(nèi)糖苷酶有著不同的連接特異性。F1能夠去除低聚甘露 糖和混合寡糖結(jié)構(gòu)，而F2和F3則分別能去除兩個(gè)分支和三個(gè)分支的結(jié)構(gòu)。

此試劑盒在去糖基化上的效果如何呢？美國(guó)西北大學(xué)的博士生A. Caulfield介紹了他的使用心得。

據(jù)Caulfield介紹，他們想要確定目的蛋白在去糖基化之后的生物學(xué)活性。糖基化的 去除可通過(guò)Western blot來(lái)評(píng)估，即蛋白條帶的分子量減少。他們的目的蛋白包含N連接糖基化。此蛋白在HEK 293細(xì)胞中產(chǎn)生，并利用其N端的FLAG標(biāo)簽來(lái)純化。之前他們?cè)囘^(guò)PNGase，但無(wú)法讓目的蛋白去糖基化。

在這一實(shí)驗(yàn)中，他們將2 ug目的蛋白與0.02個(gè)單位的內(nèi)糖苷酶F1、F2或F3及其相應(yīng)的緩沖液混合，在37°C孵育4小時(shí)。之后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的SDS-PAGE和Western blot來(lái)評(píng)估去糖基化的程度。

正如他們預(yù)計(jì)的那樣，蛋白被去糖基化，且各個(gè)樣品之間的結(jié)果相當(dāng)一致。有趣的是，內(nèi)糖苷酶F1對(duì)他們的蛋白起作用，而F2和F3則*沒(méi)效果。Caulfield認(rèn)為，了解哪種酶能使蛋白去糖基化，將帶來(lái)一些有關(guān)寡糖鏈性質(zhì)的信息。

Caulfield認(rèn)為這一試劑盒簡(jiǎn)單易用，適用于所有研究蛋白糖基化的研究人員。當(dāng)然，隨著蛋白底物不同，反應(yīng)條件可能也需要調(diào)整。

Sigma-Aldrich提供了多種去糖基化試劑盒，包括GlycoProfile I In-Gel Deglycosylation Kit、GlycoProfile II Enzymatic In-Solution Deglycosylation Kit、GlycoProfile IV Chemical Deglycosylation Kit等，適用于溶液或PAGE膠中的糖蛋白，與下游多個(gè)分析（如質(zhì)譜分析或功能研究）兼容。

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