進(jìn)口占比超90％，應(yīng)用廣泛的生物磁珠，國產(chǎn)替代進(jìn)行時(shí)

作者：SERION原料事業(yè)部

來源：維潤賽潤資訊

轉(zhuǎn)自：騰訊網(wǎng)

2020年全球體外診斷(IVD)市場規(guī)模747億美元，上游核心原料約占整體市場的10%，其中生物微球等載體系統(tǒng)約占核心原料的25%，2020年全球IVD生物微球市場空間約為18.675億美元，國內(nèi)約為17.825億元。其中免疫診斷市場中的國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光試劑廠家對(duì)生物磁珠原料的需求最大，主要是進(jìn)口為主，少量是自產(chǎn)或者國產(chǎn)。小而美的生物磁珠深刻影響IVD市場尤其免疫診斷市場的走向和發(fā)展規(guī)模。

磁珠可以與藥物、蛋白質(zhì)、酶、抗體或核酸結(jié)合，最開始的磁珠被廣泛應(yīng)用于多種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，比如藥物傳遞、磁共振成像(MRI)造影劑和熱療等。但是因?yàn)榇胖椴牧媳旧淼纳锵嗳菪院图?xì)胞毒性等等因素，限制了磁珠在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用，反而體外實(shí)驗(yàn)應(yīng)用得到更廣泛的發(fā)展，本文主要綜述磁珠在體外實(shí)驗(yàn)的用途，尤其應(yīng)用在臨床市場上的各種體外診斷技術(shù)，以及學(xué)術(shù)科研領(lǐng)域生物分子的純化應(yīng)用，比如細(xì)胞和外泌體分離、核酸提取、生物藥物的靶點(diǎn)鑒定及代謝性質(zhì)研究、蛋白純化與免疫層析等等。

早在上個(gè)世紀(jì)70年代初就有科學(xué)家嘗試使用生物微球來分離細(xì)胞，1969年科學(xué)家Wigzell和Andersson[1]就開始利用細(xì)胞表面抗原和特異性抗體的結(jié)合性質(zhì)原理，使用生物微球分離細(xì)胞，所用生物微球沒有磁性，分離速度慢，效率很低，且成本高昂。1976年科學(xué)家Guesdon和Avrameas[2]研究磁性的生物微球和抗原/抗體的連接反應(yīng)，并在1977年成功開發(fā)磁性固相酶免疫分析技術(shù)，為將來使用磁珠來分離細(xì)胞以及更廣闊的分子生物學(xué)研究應(yīng)用打下基礎(chǔ)。所用磁珠為法國Magnogel beads(MG beads)，結(jié)構(gòu)為4%的聚丙烯酰胺，4%的瓊脂糖和7%包裹在磁珠里面的氧化鐵，磁珠表面有醋酸基團(tuán)，粒徑范圍為50-160um，屬于羧基磁珠。

1. 細(xì)胞分離

1978年科學(xué)家AntoineJC等[3]首先嘗試使用磁性固相酶免疫分析技術(shù)來分離小鼠和大鼠淋巴細(xì)胞，并獲得成功，分離速度快，總回收率在80%-100%之間，所用磁珠同樣為法國的MG beads。

1982年科學(xué)家Meier和Lagenaur等[4]使用MG beads來分離少突膠質(zhì)細(xì)胞，改善了分離實(shí)驗(yàn)方案，提高分離效率，分離后少突膠質(zhì)細(xì)胞的純度為91.4%，不僅分離速度快，且成本大大降了下來。

1976年-1986年間，科學(xué)家JohnUgelstad等[5]發(fā)明并改進(jìn)了Dynabeads，一種彌散結(jié)構(gòu)且具有超順磁性的聚苯乙烯材質(zhì)的生物磁珠。科學(xué)家不僅可以精準(zhǔn)控制磁珠的粒徑大小，開發(fā)1-100um之間粒徑大小的磁珠，而且磁珠表面官能團(tuán)種類也豐富很多，廣泛用于選擇性細(xì)胞和生物分子的免疫磁分離，包括蛋白純化、細(xì)菌分離和核酸提取等。

生物磁珠技術(shù)發(fā)展至今，不僅磁珠本身的制造工藝，而且磁珠分離細(xì)胞的技術(shù)均已經(jīng)非常成熟，目前大部分磁珠廠家均有能應(yīng)用于細(xì)胞分離的產(chǎn)品，技術(shù)成熟且比較有名的廠家有德國Miltenyi，美國Dynabeads，德國MagSERIONbeads，法國Ademtech等，大部分廠家均可以提供已經(jīng)包被對(duì)應(yīng)細(xì)胞表面抗原的抗體磁珠試劑盒，使用過程簡單方便，而且主要是3.0um粒徑或者更大的磁珠，比如美國Dynabeads主打4.5um。

2.核酸提取

除了細(xì)胞分離，核酸提取也可以通過無磁的生物微球來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括瓊脂糖和硅膠等，但是效率同樣不高，通過磁珠來提取核酸的最佳方法是在磁珠表面接入鏈霉親和素，再和生物su化配體結(jié)合，通過配體捕捉DNA/RNA。1989年科學(xué)家Hultman等[6]首先使用嫁接了鏈霉親和素的Dynabeads來提取核酸并測序，所用磁珠為粒徑2.8um的Dynabeads。除了鏈霉親和素-生物su原理，使用Protein A/G磁珠捕捉抗體-蛋白質(zhì)-DNA/RNA，也是常用的方法之一。主要的廠家有美國Dynabeads，美國GE，和美國BioVision等。

現(xiàn)在臨床檢測市場上普遍使用硅基材質(zhì)的羥基/羧基磁珠來進(jìn)行核酸提取，方法是磁珠在某種酸堿條件下和溶液中的核酸通過疏水作用、氫鍵作用和靜電作用等發(fā)生特異性結(jié)合，迅速從生物樣品中分離核酸，有利于核酸的自動(dòng)化和高通量提取。這種針對(duì)臨床檢測市場的核酸提取磁珠技術(shù)比較成熟，已經(jīng)基本實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化，操作簡單方便。

3. 生物醫(yī)藥的靶點(diǎn)鑒定及代謝性質(zhì)研究。

1990s年代日本科學(xué)家Hiroshi Handa等[7]開發(fā)FG beads，一種200nm粒徑的聚苯乙烯材質(zhì)的生物磁珠，可以在有機(jī)溶劑中和各種小分子或者生物大分子配體進(jìn)行連接，研究這些配體的結(jié)合性質(zhì)和代謝功能，主要應(yīng)用于生物醫(yī)藥的靶點(diǎn)蛋白鑒定篩選和作用機(jī)理研究。

2006年科學(xué)家Hitoshi Uga等[8]用FG beads成功尋找抗癌藥MTX的作用靶點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)其抗癌機(jī)理。2010年科學(xué)家Takumi Ito等[9]用FG beads尋找鎮(zhèn)靜劑藥物Thalidomide的作用靶點(diǎn)蛋白并弄清楚其作用機(jī)理。

2014年日本科研團(tuán)隊(duì)[10]使用FG beads開發(fā)臨床監(jiān)測抗體藥物代謝功能的新技術(shù)，結(jié)合了微流控芯片技術(shù)，要求使用200nm粒徑的磁珠，粒徑要絕對(duì)均一性，稱為nSMOL技術(shù)，并與日本島津公司聯(lián)合推出上市，用于臨床監(jiān)測抗體藥物的代謝水平，在生物醫(yī)藥合同研究組織(CRO)行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。

4. 蛋白純化與免疫層析

這是生物磁珠需求量最高的應(yīng)用項(xiàng)目，所根據(jù)的原理起源于科學(xué)家Guesdon和Avrameas在1977年開發(fā)的磁性固相酶免疫分析技術(shù)，主要用來開發(fā)臨床體外診斷(IVD)檢測技術(shù)，通過用磁珠連接特異性抗體來尋找其作用蛋白/抗原并分離純化，最終檢測蛋白/抗原數(shù)量，主要的使用技術(shù)包括磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(CLIA)、微流控磁敏免疫分析技術(shù)(MIA)、熒光免疫分析技術(shù)(FIA)、單分子免疫檢測技術(shù)等。

(1) 磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(CLIA)

CLIA憑借其靈敏度高、特異性好、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢，直接檢測對(duì)象是發(fā)光材料的發(fā)光性質(zhì)，最終計(jì)算蛋白/抗原數(shù)量，在臨床應(yīng)用中迅速推廣，已經(jīng)成為免疫診斷的主導(dǎo)技術(shù)，*超過70%，國內(nèi)外IVD廠家眾多。隨著中國社會(huì)老齡化的增長，免疫診斷市場不斷增長，2019年中國免疫診斷市場規(guī)模為278億元。歐美發(fā)達(dá)國家免疫診斷中化學(xué)發(fā)光市場占比超90%，我國目前只有80%左右，且國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光試劑占比不到20%，未來五年發(fā)展?jié)摿薮螅型黄?0%。

CLIA對(duì)磁珠的性能基本要求和學(xué)術(shù)應(yīng)用的要求不同，基本要求如下：磁響應(yīng)速度快，含磁量高；分散性好、沉降速度慢；化學(xué)穩(wěn)定性高，非特異性吸附低，信噪比高；基團(tuán)含量高，鍵合力強(qiáng)，靈敏度高。目前大部分磁珠廠家均有能應(yīng)用于CLIA的產(chǎn)品，技術(shù)成熟且比較有名的磁珠廠家有德國Merck beads，日本JSRbeads，美國Dynabeads以及德國MagSERION beads等，國內(nèi)CLIA市場主要是進(jìn)口磁珠為主，1-3um粒徑的羧基磁珠常用，少量氨基磁珠和鏈霉親和素磁珠。

(2) 微流控磁敏免疫分析技術(shù)(MIA)

MIA不同于CLIA，MIA首先需要結(jié)合微流控芯片技術(shù)，成本較高，采用磁敏傳感器技術(shù)，用磁珠捕捉待測蛋白抗體并固定在芯片上，直接檢測對(duì)象是帶磁性的磁珠本體數(shù)量，具有更高的精度以及更快的檢測速度。MIA是對(duì)磁信號(hào)的檢測，可以消除生物樣品的干擾，具有超高的靈敏度，并可同時(shí)檢測多種疾病分子的能力。MIA主要使用200nm的鏈霉親和素磁珠，對(duì)磁珠的粒徑均一性和穩(wěn)定性有高要求。這項(xiàng)技術(shù)在國內(nèi)比較新穎，但微流控芯片成本較高，國內(nèi)已有廠家在開發(fā)推廣，能否全面走向臨床應(yīng)用有待觀察。

(3) 熒光免疫分析技術(shù)

POCT是即時(shí)檢測(Point-of-care testing)，是IVD市場增長最快的領(lǐng)域，常用熒光免疫分析技術(shù)(FIA)來檢測抗原/抗體，所用抗體載體多為無磁的納米級(jí)別生物微球，或者膠體金，檢測速度極快，且是傻瓜式操作，幾個(gè)小時(shí)甚至十幾分鐘即可獲得結(jié)果，技術(shù)成本比CLIA更低。但是FIA易受熒光材料本身的發(fā)光性質(zhì)所影響，常用異硫氰酸熒光素(FITC)，Ex-Em是490nm-530nm，靈敏度不高。為了提高檢測靈敏度，目前主要用時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)(TRFIA)，使用鑭系元素銪螯合物(Eu)作為熒光材料，Ex-Em是340nm-616nm，極大地提高了分析靈敏度，是現(xiàn)有的免疫檢測方法中靈敏度高的、穩(wěn)定性好的免疫檢測技術(shù)。市場上提供這種熒光微球的主要廠家是美國Bangsbeads、美國Invitrogen beads和日本TAMAGAWA的FS beads，以200nm粒徑為主。

如果使用包含TRFIA熒光材料的磁珠作為抗體載體，結(jié)合TRFIA的檢測靈敏度優(yōu)勢以及CLIA的自動(dòng)化快速分離優(yōu)勢，CLIA就能通用于POCT市場。目前POCT市場上提供這種熒光磁珠的廠家主要有美國Spherotech beads，日本TAMAGAWA的FF beads。這種新型熒光免疫分析技術(shù)目前最大的問題是熒光磁珠本身，因?yàn)榇判院蜔晒獠牧蠒?huì)有相互干擾，導(dǎo)致磁性不足或者熒光強(qiáng)度不高，如何解決這兩者的相容性問題是它走向臨床IVD市場的最大條件。

(4) 單分子免疫檢測技術(shù)

單分子免疫檢測技術(shù)，顧名思義是通過對(duì)單個(gè)抗原分子的直接計(jì)數(shù)實(shí)現(xiàn)定量檢測分析，打破業(yè)內(nèi)對(duì)免疫檢測靈敏度下限的認(rèn)知，其靈敏度可達(dá)fg級(jí)別，一般的標(biāo)記免疫技術(shù)(CLIA、熒光免疫等)高的檢測靈敏度一般在pg級(jí)別。單分子免疫檢測技術(shù)主要用于美國Quanterix的SiMoA系統(tǒng)和德國默克的SMCxPro系統(tǒng)，結(jié)合微流控芯片技術(shù)，要求使用2.5-3.0um粒徑的磁珠，粒徑要絕對(duì)均一性，是對(duì)磁珠性能和條件最為苛刻的一種前沿技術(shù)，目前生產(chǎn)此粒徑磁珠的主要廠家包括美國Dynabeads和德國MagSERIONbeads等。現(xiàn)在國內(nèi)已經(jīng)開始有IVD廠家開發(fā)單分子免疫檢測技術(shù)，受限于微流控芯片技術(shù)成本高昂的條件限制，能否用于IVD市場有待觀察。

5. 其他體外應(yīng)用簡述。

根據(jù)磁性固相酶免疫分析技術(shù)，只要在磁珠上接上特異性抗體，對(duì)于分離其他生物大分子或者特殊用途均可以使用磁珠來進(jìn)行。比如純化外泌體、分離細(xì)菌或者病毒，目前市面上廠家均有針對(duì)外泌體純化用的磁珠產(chǎn)品，原理一致，具體方案根據(jù)外泌體性質(zhì)會(huì)有很大不同，主要廠家包括美國Dynabeads和日本FG beads。

使用熒光磁珠還可以用于免疫染色，比傳統(tǒng)方法速度更快。

以上分析了磁珠用于體外實(shí)驗(yàn)的主要應(yīng)用領(lǐng)域，簡述每種領(lǐng)域?qū)Υ胖榈氖褂脳l件。臨床IVD市場上的磁珠廠家眾多，以進(jìn)口為主，性能和價(jià)格參差不齊，市面上主流使用1-3um的羧基磁珠用來生產(chǎn)CLIA試劑，其他各種粒徑的磁珠均可以用于不同的檢測技術(shù)，要根據(jù)所用檢測技術(shù)的條件篩選合適的磁珠產(chǎn)品。在學(xué)術(shù)科研領(lǐng)域，物小而精的生物磁珠，尤其在分子生物學(xué)方面的應(yīng)用更加廣闊，開闊了人類對(duì)生命科學(xué)的認(rèn)識(shí)。