OncoImmunin公司簡介

新技術開發的需求/理由：

后基因組學/蛋白質組學時代對用于在生理相關環境中測量生物活性分子的穩健，具有成本效益和高通量技術的需求不斷增長。滿足此需求的有效方法是開發工具和策略，以將報告分子傳遞到活細胞和組織中。這不僅用于引入可以評估真實生理過程的試劑，還為開發有效的療法提供了新途徑。

回應-OncoImmunin，Inc .：

OncoImmunin，Inc.由Akira Komoriya博士和Beverly Packard博士于1994年創立。該公司是馬里蘭大學技術進步計劃的早期參與者，后來畢業于一家擁有先進設施的成熟研發公司。目前，它位于馬里蘭州蓋瑟斯堡，該地區擁有中小型生物技術公司。迄今為止，OncoImmunin已獲得了多項具有新應用的美國和專有技術以及正在審查的CIP和PCT。

OncoImmunin-基礎技術的成功之處：

首先，設計，合成，驗證并申請了具有高細胞滲透性的探針，用于報告來自所有細胞內環境的蛋白酶活性。這些分子的*方面包括：（1）從蛋白酶切割位點的兩側并入氨基酸序列信息（多十個氨基酸殘基），從而不僅為生物學識別提供線性特異性，而且還提供三維特異性（2）跨完整細胞膜，可測量活細胞內的蛋白酶活性細胞（3）明智地選擇一系列熒光團，以實現多重化；（4）缺乏探針細胞毒性，可以長時間連續觀察。這些特性使用于活細胞測定的多參數應用得以開發，適用于高含量和高通量的候選藥物篩選，用于定義細胞過程的分子事件，例如細胞凋亡，自噬，炎癥，癌癥轉移和細胞介導的細胞毒性（包括ADCC）。

開發有助于細胞和組織通透性的結構元件，是OncoImmunin專有設計的基礎，該專有設計用于治療性輸送基于肽的蛋白酶抑制劑以及其他細胞內靶標。另外，遞送部分可以適合于在溶液中表現出優異的藥代動力學性質但不能進入活細胞的小分子。 

近，OncoImmunin的專有設計已應用于由DNA，RNA或任何核苷酸類似物組成的寡核苷酸領域。這種新穎的細胞內遞送技術的顯著方面是：可以在無毒性的情況下將任何序列的寡核苷酸轉運到細胞中，而無需病毒載體，脂質，鹽，去污劑，納米顆粒或電刺激。這種方法有望特別適用于基因調控，其中由于遞送載體，例如siRNA和反義治療劑，人們希望對基因表達或細胞活力的影響極小或沒有影響。

生產線：

無論是從事基礎研究還是開發研究，OncoImmunin產品都在不斷擴展，以響應生物醫學界的需求。OncoImmunin的許多探針是OncoImmunin科學家與研究團體之間相互作用的直接結果

OncoImmunin PhiPhiLux®-G1D2說明書

PhiPhiLux-G1D2

底物組成和熒光特征：

每個底物分子由熒光團（非熒光素！）均勻標記的肽組成。裂解的底物具有以下激發和發射峰：<unk>_ex=505 nm 和 <unk>_em= 530 nm。（完整的熒光，i.e.、預裂解、熒光蛋白酶底物未*淬滅（見下文）。）蛋白酶識別序列為 DEVDG我在那里₁和 P₁殘留物在紅色和藍色分別。

組件：caspase 3底物試劑盒目錄號 A304R1G-5 包括 4 個綠色-加蓋小瓶，每瓶至少含 940<unk>l底物和 1 瓶 60 mL 流式細胞儀稀釋緩沖液。caspase 3底物試劑盒目錄號 A304R1G-8 包括 8 個綠色-加蓋小瓶，每瓶至少含 770<unk>l底物和 2 瓶 60 mL 流式細胞儀稀釋緩沖液。  事件底物每瓶在 RPMI 1640 培養基中的濃度為 10<unk>M  含 25 mM HEPES。整個未開封的試劑盒可在室溫或 4⁰C. 如有小瓶  是  打開，然后應在-10 至-20 時恢復⁰C. 恢復和/或重新打開前，應輕輕離心小瓶，以除去任何液體 瓶蓋。

可能需要的其他試劑：胎牛血清 (FCS)。

通過流式細胞術分析

培養條件：

從您的方案中刪除涉及固定或透化的所有步驟。請勿修復底物-用于抗體或其他試劑標記的暴露細胞。

• 使用選定的凋亡誘導試劑（凋亡素）和/或抑制劑處理靶細胞。每個樣本集中應包括兩個對照樣本，一個有溶劑（有機助溶劑），一個沒有溶劑（有機助溶劑）。溶媒濃度不應超過 0.3% (v/v)（以 0.1% 為佳）。（如 E 中所述，FITC 峰值通道以及  應確定含和不含溶劑的半胱天冬酶陰性細胞的可能散射變化，以避免錯誤結論。）
• 處理后，將細胞等分至 1.5 至 2.0 mL 微量離心管中，離心，然后移除所有培養基以盡量減少后續底物稀釋。建議：（一）避免使用高速臺式離心機；使用類似于正常處理細胞的離心條件。（二）配備細吸頭的溫和負壓吸引，  例如，建議使用移液器吸頭。
• 向各離心細胞沉淀中加入 75<unk>l 10<unk>M底物溶液（如果 10%FCS 適當，則加入 8<unk>l FCS）。每個樣品的細胞數量應在 50 萬至 100 萬之間（見下文 A 和 B）。將細胞懸液與底物通過移液。請勿渦旋試管，因為凋亡細胞可能“脆弱”.
• 在 37 ℃ 下孵育試管⁰C 30-60 min 后進行流式細胞分析。（見下文 C。）保存底物生理 pH 條件下：避免直接暴露于底物光照和 pH.

流式細胞儀樣品制備和測定：

• 加入 1 mL 流式細胞儀稀釋緩沖液洗滌細胞一次，離心，除去所有培養基和緩沖液。用指尖輕彈試管松開細胞團塊，然后將松散團塊重懸于 1 mL 新鮮稀釋緩沖液中. 請勿渦旋含有細胞的試管，而是使用移液器重懸細胞。凋亡細胞可以是脆弱的。（參見  以下。）所有樣本應在 37 次試驗結束后 60-90 min 內進行分析^oC 孵育。
• 推薦的流式細胞儀設置：用 488 nm 激光線激發，FITC 通道檢測。在*年為對照細胞群（不存在凋亡原（如適用，使用溶劑））的細胞設置峰值通道。然后運行凋亡素處理的細胞群。
• 通過上述程序收集數據后，可以刪除 PI 陽性細胞，如果ca. 加入 10<unk>l 5-10<unk>g/ml 碘化丙啶 (PI) 溶液，并在流動中重新運行樣品c細胞計數器（PI 的終濃度ca. 200 ng/mL），帶有 FITC 的點圖vs. PE（見 D）。再分析應為加入 PI 后 5-15 min 內。

有用提示和警告：

• 孵育期間的細胞密度底物每份樣品應在 50 至 100 萬個細胞之間（盡管可分析較低濃度）。建議將直接從對數期培養物中采集細胞的對照樣品納入試驗中，以評估默認細胞凋亡水平。
• 在某些情況下，可以使用底物濃度低于 9mM（加入 FCS 至終濃度 10%v/v 將降低底物濃度至 9mM (視上)). 然而，該試劑盒已被配制成用于流式細胞術，與底物濃度at 10 mM 在大多數條件下獲得宜性能。活細胞攝取底物在 20 至 30 min 之間達到接近大值，在 37⁰C 在大多數細胞類型中。然而，作為底物攝取可能隨細胞類型和特定條件而變化，應優化孵育時間。

• 活細胞攝取底物在 20 至 30 min 之間達到接近大值，在 37⁰C 在大多數細胞類型中。然而，作為底物攝取可能隨細胞類型和特定條件而變化，孵育時間應為 優化
• 建議為了鑒別 PI 陰性凋亡和未誘導的細胞群，應首先在不存在 PI 的情況下進行分析，然后在加入 PI 后進行第二輪數據采集。樣本  所有樣本的稀釋體積應相同。點圖之間的比較 (FITC)vs. PE）的這兩組樣本將能夠輕松識別 PI 陰性細胞群，因為在兩組點圖中，這些細胞保持在 PE 軸上的相同位置。因此，如果將門控放置在 PI 陰性細胞周圍，然后將該門控內的細胞繪制在 FL1 直方圖中，則該方法將導致對未誘導和凋亡的 PI 陰性細胞進行分析。
• 如果一群熒光強度很低的細胞，i.e出現低于未誘導細胞群的情況，則很可能 (i) 樣品過度誘導和/或 (ii) 終溶劑濃度導致毒性。因此，應納入溶劑對照樣本。

為了在直方圖中看到亮的凋亡細胞群，細胞必須保持其膜的完整性。請注意：所有 OncoImmunin 的原理底物工作是完整的底物擴散穿過所有膜，i.e., 血漿以及細胞膜，通過被動擴散；一旦底物已被其同源蛋白酶識別和裂解，裂解的片段大部分保留在蛋白酶所在的膜側。因此，裂解底物片段在 PI 陰性細胞中產生陽性信號，一旦細胞失去其膜完整性（如 PI 陽性所示），裂解的片段可能擴散出細胞。由于完整底物的熒光未被*淬滅，加載底物的未誘導細胞群的熒光高于未暴露于底物的細胞群。因此，如果在過度誘導或暴露于高濃度有機助溶劑的情況下，膜完整的活細胞的通透性屏障喪失，那么完整以及裂解的碎片可能從誘導細胞中丟失。

在某些情況下，分析尚未發生半胱天冬酶活化的早期時間點，通過觀察峰值通道數量的減少，觀察供試化合物本身是否誘導膜滲透性變化可能是有益的。一般而言，PI 陽性或 TUNEL 檢測陽性細胞百分比較高的樣本中的細胞將處于晚期凋亡和/或壞死。PhiPhiLux 的使用^®-G₁D₂對于含有低百分比 PI 陽性細胞的樣本是宜的。

在大多數情況下，建議降低凋亡素濃度，而不是簡單地尋找更早的時間點。  PhiPhiLux 分析的適當時間點^®-G₁D₂-陽性細胞應如此大百分比  存在 PI 陰性細胞：理想情況下，樣本應包含兩者未誘導和半胱天冬酶⁺/PI^-細胞。  條件  應避免僅觀察到單一人群。在熒光顯微鏡下檢查細胞可能有助于確定確切的細胞凋亡誘導 條件。

樣品數據：

PhiPhiLux-G1D2   熒光顯微鏡分析

培養條件：

從您的方案中刪除涉及固定或透化的所有步驟。請勿修復底物-用于抗體或其他試劑標記的暴露細胞。

在大多數細胞培養物中，少數細胞默認為死亡；應將其用作陽性對照。在無默認死亡的罕見情況下，推薦使用已確定的凋亡素治療，例如 1<unk>M Staurosporine，以產生陽性對照。

用于標準（非共聚焦）熒光顯微鏡

• 用選擇的凋亡誘導試劑和/或抑制劑處理靶細胞。每個樣本集中應包括兩個對照樣本，一個有溶劑（有機助溶劑），一個沒有溶劑（有機助溶劑）。溶媒濃度不應超過 0.3% (v/v)（以 0.1% 為佳）。（如上所述，對于流式細胞術，應確定含和不含溶劑的半胱天冬酶陰性細胞的可能變化，以避免錯誤結論。）
• (a) 對于懸浮細胞，向每個離心的細胞沉淀中，加入 75ml of 10 mM 底物溶液（加入 8ml of FCS，如果 10%FCS 合適）。每個樣品的細胞數量應在 50 萬至 100 萬之間（見上文 A 和 B）。用指尖輕彈試管，混合含細胞和底物的混懸液. 請勿渦旋含有細胞的試管，因為凋亡細胞可能  “脆弱”.

(b) 對于貼壁細胞，加入足夠的底物溶液，使單層細胞或單個細胞*覆蓋。與混懸液相同  細胞，在加入前一定要去除所有培養基底物-含溶液，以盡量減少稀釋底物。（對于貼壁細胞，建議培養皿底部附有玻璃蓋玻片。（聯系 OncoImmunin,Inc.針對  此類細胞培養皿的來源。）

3. 在試管或培養皿中以 37 ℃ 孵育細胞樣本^oC 30～60 min。確切的孵育時間為細胞  類型和誘導劑  特定。保存底物生理 pH 條件下：避免直接光照至底物以及暴露于 pH.

4. 用 PhiPhiLux 孵育后即刻®-G₁D₂ 底物 溶液：

• 對于懸浮細胞，用 1 mL 流式細胞計數緩沖液或任何生理緩沖液（如 PBS）稀釋，離心，并用 1 mL 新鮮緩沖液替換上清液。根據熒光顯微鏡的燈功率和檢測能力，重復細胞清洗（通常再清洗 1-2 次）。每次洗滌后在熒光顯微鏡下檢查細胞，觀察是否  背景熒光足夠暗，可區分未處理對照細胞和處理細胞。

(b) 對于貼壁細胞，移除 PhiPhiLux®-G₁D₂ 底物 溶液 和 清洗 溫和地 與 緩沖液。 執行 a 相似 編號 of 細胞

懸浮細胞樣本推薦的清洗循環。每次循環后，在熒光顯微鏡下觀察背景熒光水平。清洗貼壁細胞時應特別小心，因為與非凋亡細胞相比，凋亡細胞通常更容易從平板上分離。因此，建議保存所有洗滌液，直至可識別陽性細胞。

5. 推薦的顯微鏡設置為熒光濾光片。

用于共聚焦顯微鏡

由于共焦儀器中存在針孔及其光學過濾效應，可刪除清洗步驟。因此，人們可以  具有底物在整個實驗過程中存在或在給定實驗過程中的任何時間添加底物。

事件底物適用于此類型實驗的濃度應小于貯備液濃度 10mM. 建議一系列的底物稀釋范圍從 5 到 1mM 執行。

當使用共聚焦顯微鏡時，必須設置適當的探測器增益和激光功率設置。一般在任何細胞培養中，都有少量的凋亡細胞，i.e. 默認死亡的細胞。后者與健康對照細胞結合使用可作為設置動態范圍的限制。一個很好的起點是使用默認死亡細胞的信號作為大值的 90%，健康細胞作為陰性或較低的信號水平。

注意：在多個底物濃度，與胞外域的像素強度相比，健康細胞胞內域的像素信號強度通常較低。這是由于完整細胞的膜通透性屏障。  當給定的半胱天冬酶活性被激活后，同源蛋白酶裂解底物，由于細胞的去猝滅，細胞內像素強度水平將高于細胞外強度底物。如果  細胞質面積僅達到細胞外水平，因此在該時間點不能明確聲明該熒光強度增加僅由半胱天冬酶活性引起，因為僅給定細胞的膜滲透性增加可解釋該增加。然而，強度增加高于背景相關強度底物只有當熒光團與底物通過靶半胱天冬酶對完整細胞的作用去淬滅底物通過切割底物分成兩個片段。

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